La propiedad cuticular afecta la sinergia insecticida de los principales componentes del aceite de tomillo contra las moscas domésticas, Musca domestica.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12654 (2023) Citar este artículo

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Los aceites esenciales de plantas son mezclas intrincadas que comprenden predominantemente monoterpenos y algunos sesquiterpenos. Estos aceites muestran diversas bioactividades contra organismos específicos, que a menudo surgen de interacciones complejas entre sus constituyentes, que pueden demostrar efectos sinérgicos o antagónicos. A pesar de su amplio uso como insecticidas botánicos, los mecanismos detrás de estas interacciones y sus efectos sobre la bioactividad no se conocen bien. Este estudio investigó la interacción sinérgica del timol y el p-cimeno, dos componentes principales del aceite esencial de Thymus vulgaris, en las larvas y adultos de la mosca doméstica Musca domestica. Los resultados mostraron que el p-cimeno tenía sinergia con la actividad insecticida del timol en moscas domésticas adultas, pero no en las larvas. Los análisis y bioensayos de GC-MS indicaron que el aumento de la penetración cuticular del timol por el p-cimeno fue el mecanismo de sinergia, que se observó solo en los adultos. Se propusieron dos rutas potenciales: la expansión del área de humectación o la alteración de la integridad cuticular mediante la disolución de la capa de cera. Los resultados de la aplicación secuencial y del bioensayo de tratamiento de gran volumen sugirieron que el primero era el mecanismo más probable. Además, la hidrofobicidad de la cutícula parecía crítica para esta sinergia específica de esta etapa. Los adultos sin cera no lograron mostrar toxicidad sinérgica, mientras que las larvas recubiertas artificialmente de cera obtuvieron un efecto sinérgico. En general, los hallazgos proporcionan información sobre el mecanismo sinérgico de la actividad insecticida de los aceites esenciales de plantas y sugieren aplicaciones potenciales en el desarrollo de estrategias efectivas utilizando sinergistas que mejoran la penetración.

Las crecientes preocupaciones sobre los impactos ambientales y de salud de los insecticidas sintéticos han inspirado la búsqueda de estrategias de control de plagas más seguras, y los aceites esenciales de plantas se consideran candidatos alternativos. Parecen prometedores para controlar diversas plagas de insectos, ya que generalmente se consideran menos tóxicos para los humanos y los animales salvajes que los pesticidas convencionales1. Hoy en día, se encuentran disponibles en el mercado muchos insecticidas botánicos comercializados2,3,4,5. La mayoría de los aceites esenciales se extraen de las sumidades florales, la corteza, la resina y las semillas de diversas fuentes vegetales mediante destilación al vapor6. Están compuestos por varios constituyentes, principalmente monoterpenos y sesquiterpenos7. La complejidad química y la diversidad estructural de los componentes de los aceites esenciales a menudo dan como resultado una bioactividad combinada que es mayor o menor que la de los componentes individuales; sin embargo, el mecanismo de estas interacciones intermoleculares se comprende menos.

Muchos aceites inducen una rápida aparición de respuestas de envenenamiento en los insectos, lo que sugiere que los componentes activos de estos aceites pueden influir directamente en el sistema nervioso y exhibir actividad insecticida8,9,10. Los estudios han demostrado que la diversidad estructural de los principales compuestos de los aceites esenciales puede indicar múltiples modos de acción. Por ejemplo, el timol y la nootkatona, los componentes principales de los aceites de tomillo y madera de cedro, respectivamente, modulan los receptores del ácido gamma-aminobutírico (GABA) de Drosophila melanogaster de maneras opuestas11,12. También se han propuesto otros objetivos neuronales, incluidos los sistemas octopaminérgicos, tiraminérgicos y colinérgicos, como posibles sitios/sistemas objetivo para diversos compuestos derivados de aceites esenciales13,14,15,16.

Se han propuesto varias hipótesis sobre el mecanismo sinérgico de los aceites esenciales de plantas. Al igual que los sinergistas convencionales, los aceites de albahaca y geranio inhiben la actividad tanto del citocromo P450 como de la glutatión-S-transferasa, que son las principales enzimas desintoxicantes de tóxicos17. En otro estudio, el limoneno amplificó la respuesta electrofisiológica al estragol en el sistema nervioso central de larvas de Spodoptera litura18. Contra otros insectos lepidópteros como Trichoplusia ni, se ha propuesto como otro posible mecanismo sinérgico cambiar la penetración cuticular de los compuestos activos reduciendo la tensión superficial de la mezcla3,19.

La mosca doméstica, Musca domestica L., es una plaga de insectos cosmopolita vector de enfermedades graves, como tifoidea, disentería, difteria, lepra, tuberculosis y parásitos intestinales20. Como muchos otros insectos, la mosca doméstica sufre una metamorfosis completa, donde su hábitat, fisiología y comportamiento son distintivamente específicos de cada etapa. Las larvas ocupan hábitats húmedos, como cadáveres, estiércol o basura. Esto puede estar relacionado con una falta de hidrofobicidad cuticular21,22. De hecho, las larvas favorecen activamente las condiciones de humedad para evitar la deshidratación23. Las moscas domésticas adultas también son susceptibles a la pérdida de agua y desarrollan una capa de cera hidrofóbica compuesta de hidrocarburos de cadena larga (> C20) para evitar la pérdida de agua24,25.

En el presente estudio, se examinó la sinergia insecticida en etapas específicas tanto en moscas domésticas adultas como en larvas. Presumimos que una mayor penetración cuticular afectaría la toxicidad de la mezcla binaria de timol y p-cimeno, y que la diferencia en la composición cuticular afectaría la permeación y la toxicidad. Realizamos estudios comparativos sobre larvas y adultos de moscas domésticas susceptibles a los insecticidas y proporcionamos evidencia de que la combinación de compuestos tratados y propiedades de la superficie de la plaga objetivo es fundamental para ejercer sinergia.

Se identificó un total de 83,6% de los componentes del aceite de tomillo mediante análisis GC-MS, y el p-cimeno fue el compuesto más abundante (38,0%), seguido del timol (31,8%) (Tabla complementaria S1). Linalol (4,1%) y α-pineno (3,1%) también estaban presentes en el aceite, pero constituían notablemente menos que los dos compuestos primarios. Se evaluó el papel de estos cuatro compuestos principales en la toxicidad general del aceite contra las moscas domésticas.

Por aplicación tópica, la actividad insecticida del aceite de tomillo estuvo representada por una LD50 de 83,1 μg/insecto para adultos y 86,0 μg/insecto para larvas, mientras que el control positivo permetrina tuvo una LD50 de 0,23 y 25,76 μg/insecto para adultos y larvas. respectivamente (Tabla 1). No se observó mortalidad en el control negativo tratado con acetona.

Las mezclas de los componentes principales se prepararon para el ensayo de eliminación de compuestos, cuya notable diferencia específica de etapa se observó entre adultos y larvas (Tabla 2). La mezcla de los cuatro componentes principales mostró estadísticamente la misma mortalidad que el aceite original en ambas etapas (P <0,05), lo que indica que esos compuestos fueron responsables de la actividad general del aceite. En los adultos, las mezclas artificiales que carecían de timol mostraron una toxicidad reducida. Aunque la eliminación del p-cimeno individual de las mezclas artificiales no afectó la toxicidad general, los tres tratamientos que carecen tanto de timol como de p-cimeno (α-pineno + linalol, α-pineno y linalol) mostraron estadísticamente una mayor disminución de la mortalidad, lo que indica el efecto potenciador del p-cimeno sobre la toxicidad del timol contra las moscas domésticas adultas (F13,56 = 92,77, P <0,001). Por el contrario, la eliminación de timol resultó en la pérdida completa de toxicidad (F13,56 = 128,92, P <0,001) en las larvas, independientemente de si se eliminó el p-cimeno o no.

Se utilizaron ensayos de dosis-respuesta para caracterizar mejor la sinergia entre timol y p-cimeno (Tabla 3). En adultos, la toxicidad tópica del timol fue 2,2 veces mayor que la del p-cimeno (LD50 = 121,4 μg/insecto frente a 270,4 μg/insecto). Cuando se mezclaron en su proporción natural (4,6:5,4), los dos compuestos interactuaron sinérgicamente con un valor R de 1,7 (LD50 observada = 101,1 μg/insecto y LD50 esperada = 172,8 μg/insecto). Asimismo, fueron sinérgicos en otras proporciones (R = 1,6, 2,0 y 1,98 para [timol:p-cimeno] 1:1, 1:2 y 1:4, respectivamente). De lo contrario, eran simplemente aditivos en proporciones de 1:9, 2:1, 4:1 y 9:1. En las larvas, el timol fue 10,7 veces más tóxico que el p-cimeno (LD50 = 80,6 μg/insecto y 864,3 μg/insecto, respectivamente) y al mezclarlos se demostró que ambos eran antagónicos (1:2, 4,6:5,4, 1:1, 2:1). , y 4:1) o efectos aditivos (1:9, 1:4 y 9:1).

Para comprobar si la sinergia observada se produjo debido a una mayor penetración cuticular, se realizaron ensayos de aplicación e inyección divididas (Tabla 4). No se observó sinergia cuando los dos compuestos se administraron por separado en diferentes partes del tórax. En los ensayos de inyección, los compuestos inyectados fueron más tóxicos que cuando se aplicaron tópicamente, ya que superaron la barrera cuticular. Para el timol, la toxicidad aumentó 7,9 veces cuando se inyectó (LD50 = 15,3 μg/insecto frente a 121,4 μg/insecto), aunque fue sólo 1,7 veces mayor para el p-cimeno (LD50 = 159 μg/insecto frente a 270,4 μg/insecto). Sin embargo, cuando se inyectó la mezcla no se observó ninguna sinergia. Más bien, la combinación era antagónica cuando se mezclaba en una proporción de 1:2 (R = 0,5).

Se realizaron tratamientos secuenciales para evaluar si la administración de timol y p-cimeno a intervalos de una hora afecta su ruta de penetración. La Tabla 5 muestra que no hubo interacción significativa entre los compuestos cuando se administró timol antes de p-cimeno ((R = 0,6 en 4,6:5,4; R = 0,5 en 1:2) o viceversa (R = 0,6 en 4,6:5,4; R = 0,7 a 1:2). Además, no se observó diferencia estadística en los ángulos de contacto de la capa de cera con timol o p-cimeno en comparación con la aplicación en blanco y acetona (P > 0,05), lo que indica que el efecto sinérgico entre los dos Es posible que los compuestos no se deban a una alteración de la integridad de la capa de cera cuticular (consulte la Figura complementaria S3 para obtener más detalles).

El tratamiento de gran volumen indicó que la administración de 1,5 μL de una mezcla de timol y p-cimeno en lugar de 0,5 μL mojó completamente la superficie y no produjo un efecto sinérgico (R = 0,7 en 4,6:5,4; R = 0,6 en 1:2). , lo que sugiere que la mayor penetración de los compuestos puede deberse a la mayor humectación de la superficie cuando se mezclaron los dos compuestos. Por tanto, los resultados indican que el aumento del área de humedecimiento puede ser responsable de la sinergia observada.

El efecto potenciador de la penetración del p-cimeno sobre el timol se confirmó comparando las cantidades de penetración in vivo 1 h después del tratamiento en adultos y larvas con timol y p-cimeno individualmente y con una mezcla de los mismos. En adultos, la cantidad interna de timol aumentó significativamente cuando se administró dentro de la mezcla en comparación con la que se administró solo (Fig. 2a, gl = 4, P = 0,005), pero ese no fue el caso del p-cimeno. En las larvas (donde no se observó sinergia), la penetración de ambos compuestos no difirió entre los tratamientos de administración (Fig. 2b). Además, cuando los adultos fueron tratados con volúmenes mayores de las soluciones de prueba (1,5 μL), la cantidad de penetración de ambos compuestos no difirió entre los tratamientos de administración, como se predijo en el bioensayo (Fig. 2c). En particular, a pesar de la aplicación de la misma dosis de timol y p-cimeno, la penetración aumentó significativamente cuando se usó un volumen mayor durante el individuo (Fig. 2a y c; df = 4, P = 0,022 para timol; df = 4, P = 0,042 para p-cimeno) y tratamientos combinados.

Para evaluar el papel sinérgico de la capa de cera cuticular, las propiedades humectantes epidérmicas se intercambiaron artificialmente (Fig. 1 y Tabla 6). Los adultos desprovistos de la capa de cera hidrofóbica (DA) fueron 2,1 y 1,4 veces más susceptibles que los adultos intactos (IA) al timol y p-cimeno, respectivamente (LD50, DA: 57,8 μg/insecto, IA:121,4 μg/insecto para timol ; DA: 189,4 μg/insecto, IA: 270,4 μg/insecto para p-cimeno). Por el contrario, las larvas recubiertas artificialmente con hidrocarburo de cadena larga (n-eicosano) (WL) fueron 3,2 y > 2,0 veces más tolerantes que las larvas intactas (IL) al timol y p-cimeno, respectivamente (LD50, WL: 261,3 μg/ insecto, IL:80,6 μg/insecto para timol; WL: > 1714,0 μg/insecto, IL:864,3 μg/insecto para p-cimeno). Ambas combinaciones sinérgicas en aplicación tópica en moscas domésticas adultas intactas (timol:p-cimeno = 0,46:0,54, 0,33:0,67) no lograron mostrar toxicidad sinérgica en adultos desparafinados con valores R de 0,66 y 0,77, respectivamente. Por otro lado, mientras que las dos combinaciones no fueron sinérgicas contra las larvas intactas, las dos mezclas fueron sinérgicas con las larvas recubiertas de cera artificial, con valores de R de 2,00 y 2,11, respectivamente. Estos cambios en las interacciones que siguen a la modificación de la capa de cera indican el papel crucial de la capa de cera en el sinergismo.

Cambio de las propiedades humectantes de la superficie en adultos desparafinados y larvas recubiertas de cera artificial. Se aplicaron cuatro microlitros de agua desionizada mediante el método de gota colgante. Los adultos intactos mostraron superhidrofobicidad (a) pero se volvieron humectables después de enjuagarlos con hexano (b). Las larvas intactas mostraron una hidrofilicidad moderada (c), mientras que eran más hidrofóbicas después de ser recubiertas con cera artificial (d).

De acuerdo con estos resultados, el p-cimeno no mejoró la penetración in vivo del timol en el DA (Fig. 2d). Además, en el WL, los compuestos penetraron más fácilmente cuando se administraron como una mezcla que cuando se administraron individualmente (Fig. 2e, P = 0,009 para timol; P = 0,046 para p-cimeno).

Análisis GC-MS de la penetración cuticular de timol, p-cimeno y sus mezclas después de tratar un volumen estándar (0,5 µL) de soluciones de prueba en adultos (a) y larvas (b). También se investigó la penetración en tratamientos de gran volumen (1,5 µL) (c). Cuando se intercambiaron las propiedades cuticulares, la interacción general se revirtió correspondientemente, ya que las cantidades de penetración de ambos compuestos no cambiaron en los adultos desparafinados (d), mientras que aumentaron en las larvas recubiertas de cera (e).

En el presente estudio, investigamos el mecanismo sinérgico de los dos componentes principales del aceite de tomillo, timol y p-cimeno, contra las etapas adulta y larvaria de las moscas domésticas. La toxicidad sinérgica se observó sólo en adultos, donde el p-cimeno mejoró la penetración cuticular del timol. Otros bioensayos revelaron que el aumento de la penetración se debía a la ampliación del área de humectación y no a la alteración de la capa protectora. Una comparación entre adultos cubiertos de cera y larvas sin cera confirmó el papel crucial de la capa de cera epicuticular en esta sinergia.

El aceite de tomillo tiene notables propiedades insecticidas y es uno de los aceites esenciales más frecuentemente reportados26,27,28,29. La composición química de los aceites esenciales puede variar dinámicamente dependiendo del método de extracción, los antecedentes genéticos (cultivar) de la planta fuente y las tensiones abióticas (temperatura y humedad) y bióticas (densidad, herbivoría, infección) a las que está expuesta la planta fuente30. ,31,32,33,34. La composición química del aceite de tomillo utilizado en este estudio difirió de la de otros estudios3,35. Las diferencias en los componentes principales y sus proporciones relativas pueden dar lugar a diferencias en la actividad insecticida36. Además, es bien sabido que no sólo los componentes principales sino también los menores pueden contribuir significativamente a la actividad general de los aceites esenciales37.

Los informes de mayor toxicidad en mezclas de aceites esenciales han sido frecuentes en la literatura19,26,38,39. Sin embargo, en comparación con la gran cantidad de informes sobre efectos sinérgicos, presumiblemente debido a la diversidad de estructuras y composiciones químicas, aún está por explorarse una comprensión generalizada de sus mecanismos sinérgicos. Por ejemplo, nuestro estudio sobre moscas domésticas adultas mostró que una mezcla binaria de timol y p-cimeno era sinérgica en proporciones naturales (4,6:5,4, p/p), 1:1, 1:2 y 1:4, pero no en 9 :1, 4:1, 2:1 o 1:9, lo que indica interacciones dependientes de la composición en sinergia. Se han propuesto dos categorías de interacciones sinérgicas: internas y externas. Estudios anteriores han demostrado que los compuestos sinérgicos pueden modular la sensibilidad nerviosa para aumentar la toxicidad de los compuestos activos primarios. Esto se clasifica como una interacción interna18,40,41. Un estudio reciente encontró que la sinergia interna puede no limitarse a los insecticidas neurotóxicos sino también a los bloqueadores respiratorios42. Por el contrario, la combinación sinérgica en el presente estudio no fue sinérgica cuando se inyectó en los adultos, lo que sugiere que se trata de un efecto externo. Además, la aplicación tópica dividida no logró aumentar la toxicidad, lo que indica que la sinergia entre el timol y el p-cimeno sólo se produce cuando se aplican conjuntamente como una mezcla. Varios estudios previos han propuesto que la permeación cuticular mejorada podría ser un mecanismo sinérgico externo de una toxicocinética3,19,43,44. Demostramos que la recuperación de timol de los extractos linfáticos de adultos aumentó en respuesta a la administración de la mezcla de timol/p-cimeno, pero no del extracto linfático de larvas. Esta fuerte correlación con los resultados del bioensayo confirmó el papel del p-cimeno como potenciador de la penetración en interacciones sinérgicas.

Anteriormente se planteó la hipótesis de que el p-cimeno altera la integridad fisicoquímica de la capa cuticular en el garfio de la col Trichoplusia ni3. Generalmente, las capas de cera cuticular se consideran una barrera a la penetración de insecticidas. Por ejemplo, la toxicidad de los insecticidas aumenta cuando la capa de cera de las moscas domésticas adultas se desgasta con cloroformo, posiblemente debido a una mayor penetración45. Un estudio reciente también demostró que el aceite de rosa mosqueta que contiene 1,8-cineol y alcanfor disuelve la flor protectora de cera del insecto escama Icerya aegyptiaca, aumentando así la penetración de la matrina tóxica44. Como se muestra en este estudio, la capa de cera parece funcionar como una barrera para los tóxicos; se observó una mayor toxicidad cuando se eliminó la capa de cera en adultos y se encontró una disminución de la mortalidad en larvas recubiertas artificialmente de cera. La alteración de la capa de cera por el p-cimeno podría sugerirse como mecanismo potencial de sinergia sobre la toxicidad del timol en las moscas domésticas adultas. Sin embargo, nuestro estudio sugiere que el p-cimeno puede no afectar la integridad de la capa de cera, ya que no se encontró un aumento de la toxicidad del timol en la aplicación secuencial. Más bien, sería más convincente una mejor difusión del timol mediante la adición de p-cimeno debido a su baja hidrofobicidad del p-cimeno. La administración de timol en un mayor volumen de disolvente aumentó su toxicidad (de 121,4 a 89,8 μg/insecto de LD50), y la combinación en un mayor volumen no mostró toxicidad sinérgica ni aumento de la penetración cuticular. Estas observaciones indicaron que el p-cimeno se propaga a través del timol para cubrir un área mayor que la que puede por sí solo, estimulando la penetración simultánea de más moléculas a través de la cutícula cerosa.

Debido a su pequeño tamaño, los insectos son muy vulnerables a la pérdida de agua y sus capas de cera cuticular desempeñan un papel crucial a la hora de protegerlos de la desecación. La tolerancia a la desecación varía con la disponibilidad de agua porque los insectos de hábitats áridos tienen menos transpiración cuticular que los insectos mésicos46,47,48. El mecanismo general de impermeabilización de la cera cuticular es cuantitativa y cualitativamente diverso49. En particular, se ha demostrado que la cantidad de hidrocarburos saturados en la capa de cera se correlaciona negativamente con la pérdida de agua50. Se ha observado un aumento de n-alcanos en la capa de cera durante la estación cálida en varias especies, incluidas Centruroides sculpturatus, Eloedes armata y Cicindela obsoleta46,51,52. Aunque las moscas domésticas tienen una vida más corta y no presentan cambios estacionales, se han observado diferencias en la composición de la cera cuticular entre adultos y larvas. Los adultos son terrestres y tienen una mayor necesidad de evitar la pérdida de agua, mientras que las larvas viven en un hábitat mésico donde la pérdida de agua es menos significativa25,53. Aunque en el presente estudio no se realizó ningún análisis de la composición de la cera cuticular, la diferencia en la hidrofobicidad fue indiscutible al observar el comportamiento de las gotas de agua en la cutícula (Fig. 1a y c). Cuando se manipuló la hidrofobicidad cuticular de adultos y larvas, los resultados del bioensayo cambiaron en consecuencia, lo que indica que la hidrofobicidad cuticular desempeña un papel en la sinergia. Estos resultados resaltan las diferencias específicas de la etapa en la susceptibilidad a los compuestos insecticidas y sugieren que una mayor investigación sobre la toxicocinética de los insecticidas en términos de propiedades cuticulares podría beneficiar las estrategias de manejo de plagas.

Debido a que el uso prolongado de insecticidas convencionales ha llevado a las plagas de insectos a desarrollar rasgos de resistencia, los estudios han sugerido que el engrosamiento cuticular por sobreproducción de la capa de cera puede conferir resistencia al retardar la penetración de los insecticidas54,55. En cepas resistentes que poseen tales mecanismos, la búsqueda de sinergistas penetrantes eficientes puede ayudar a superar el problema de la resistencia. Sin embargo, se requiere más evidencia experimental para apoyar esta hipótesis.

Para concluir, planteamos la hipótesis de que una mayor penetración cuticular es el mecanismo sinérgico potencial de los dos componentes principales del aceite de tomillo, timol y p-cimeno, en la mosca doméstica, y la diferencia en la composición cuticular, así como la hidrofobicidad de la superficie, determinarían el grado de penetración. y toxicidad. Nuestro estudio exhaustivo muestra claramente la diferencia dependiente de la etapa en la toxicidad sinérgica junto con la permeación cuticular de los compuestos. Al examinar la química de la superficie de las plagas objetivo, se pueden desarrollar estrategias de control de plagas más efectivas utilizando sinergistas que mejoren la penetración.

La cepa susceptible de mosca doméstica se obtuvo de la Agencia Coreana para el Control y la Prevención de Enfermedades (KCDC) y se mantuvo en el insectario de la Universidad Nacional de Seúl. La colonia no había estado expuesta a ningún pesticida conocido durante más de nueve años. Las larvas nacidas se alimentaron con una mezcla de dieta para roedores (Purina 38,057; Purina, St. Louis, MO, EE. UU.), aserrín de roble y agua destilada en una proporción de peso de 9:1:10. Las pupas se transfirieron a jaulas con malla (30 × 30 × 30 cm) y a los adultos emergidos se les proporcionó una solución de sacarosa al 10%. Los insectos se criaron en condiciones de 26 ± 2 °C, 20 ± 5% HR y un fotoperiodo de 12:12 (L:D).

El aceite esencial de tomillo destilado al vapor extraído de las sumidades floridas y las hojas de Thymus vulgaris (L.) se adquirió del Dr. Mercola® (Cape Coral, FL, EE. UU.). La planta se cultivó mediante un método certificado orgánico del USDA, de acuerdo con el Programa Orgánico Nacional (NOP), y el uso de partes de la planta en el estudio cumple con las pautas internacionales, nacionales y/o institucionales. Cera artificial (n-eicosano, 99%) y cuatro de los componentes principales del aceite de tomillo, a saber, timol (> 98,5%), p-cimeno (99%), linalool (97%) y α-pineno (98%). , se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). La acetona (99,5%) y el n-hexano (95,0%) se adquirieron de Daejung Chemicals (Siheung-si, Gyeonggi-do, Corea del Sur). LG Chem (Daejeon, Corea del Sur) proporcionó permetrina de grado técnico (95,9%) y se utilizó como control positivo.

Se utilizaron larvas tardías del tercer estadio para examinar la actividad larvicida de los aceites y compuestos seleccionados. Se fijaron diez larvas a un aparato diseñado en laboratorio (Figura complementaria S1). Cada larva (en un tubo de retención) recibió 3 µL de solución de prueba en los segmentos torácicos y luego se secó durante 1 h. Las larvas se sacaron suavemente de las ataduras y se transfirieron a una taza de 385 ml con 10 g de alimento para larvas para su observación.

La toxicidad por contacto adulticida se evaluó en moscas hembra entre 5 y 10 días después de la emergencia. Se anestesió a un grupo de diez moscas con CO2 de grado médico y se las colocó en una placa de enfriamiento. El aceite de prueba y los compuestos se diluyeron en acetona y se aplicaron tópicamente 0,5 µl de la solución de prueba sobre el noto torácico de la mosca usando una jeringa Hamilton Microliter (Hamilton Company, Reno, NV, EE. UU.) equipada con un dispensador repetitivo. Después de que se evaporó el disolvente, los insectos tratados se transfirieron a vasos limpios para su observación.

Las moscas tratadas se mantuvieron en condiciones de observación durante 24 h, después de lo cual se registró la mortalidad y se determinaron los valores de LD50. Las pruebas se repitieron tres o cuatro veces.

El análisis GC-MS indicó que el p-cimeno (38,0%), timol (31,8%), linalol (4,1%) y α-pineno (3,1%) eran los principales componentes del aceite de tomillo (Tabla complementaria S1 y Fig. S2). . Se realizó un ensayo de eliminación de compuestos para evaluar la contribución de cada compuesto a la actividad insecticida general del aceite37. Brevemente, se preparó una serie de aceites artificiales utilizando los cuatro componentes principales en sus proporciones naturales, ya sea como una mezcla completa u omitiendo los compuestos objetivo. Esto resultó en 10 aceites artificiales. Cada aceite artificial se aplicó tópicamente en una dosis equivalente a la LD90 del aceite de tomillo tanto a larvas como a adultos, como se mencionó anteriormente, y se identificaron los principales componentes activos: timol y p-cimeno. Todos los demás procedimientos experimentales se centraron en estos dos ingredientes activos.

En el siguiente experimento, se prepararon mezclas binarias de 10 proporciones diferentes y se investigaron más a fondo sus interacciones dependientes de la proporción. Se estimaron los valores de DL50 de las mezclas y se determinaron sus interacciones con base en el modelo de Wadley56. La LD50 esperada se calculó de la siguiente manera:

donde a es la proporción del compuesto A en la mezcla y LD50A representa la LD50 observada del compuesto A, y así sucesivamente. El índice de sinergia (R) se calculó de la siguiente manera:

donde la interacción se definió como sinérgica (R > 1,5), aditiva (1,5 ≥ R > 0,5) o antagonista (R ≤ 0,5).

Estudios anteriores han sugerido dos métodos de bioensayo para distinguir el efecto de mejora de la penetración (como mecanismo sinérgico) de otras interacciones fisiológicas en un insecto lepidóptero: un ensayo de aplicación dividida y un ensayo de inyección19,43. El método de aplicación dividida se realizó aplicando simultáneamente timol al esternón y p-cimeno al notum torácico (o viceversa) de las moscas hembra. Para el ensayo de inyección, se inyectó 1 μL de solución de prueba (ya sea compuestos individuales o la mezcla binaria) en el tórax dorsal de los adultos utilizando una bomba de microjeringa manual (DMP, World Precision Instruments, Sarasota, FL, EE. UU.) y el LD50. Se determinaron los valores después de 24 h. Se utilizaron dos mezclas binarias para este y todos los procedimientos posteriores, a saber, timol:p-cimeno 0,46:0,54, que refleja las proporciones relativas de los compuestos en el aceite de tomillo probado, y 0,33:0,67 (o 1:2), que refleja la relación que mostró la mayor sinergia (R = 1,96) en la aplicación tópica.

Se realizaron dos ensayos de aplicación tópica adicionales para investigar más a fondo los efectos de mejora de la penetración. El primer ensayo examinó si un compuesto anterior podría facilitar la permeación de otro aplicando ambos compuestos individualmente en el mismo lugar con una diferencia de 1 hora entre sí. En el segundo ensayo, el volumen de la aplicación se aumentó de 0,5 a 1,5 µL, tratando así todo el cuerpo de la mosca adulta.

Para examinar el impacto de los compuestos de prueba y el disolvente sobre la capa de cera cuticular, se midieron los ángulos de contacto de la superficie tratada. Se aplicaron tópicamente timol y p-cimeno en sus dosis LD50 en el tórax de moscas domésticas adultas intactas como se mencionó anteriormente, usando acetona como control negativo. Después de una hora de incubación, las moscas domésticas fueron anestesiadas con CO2. Se aplicaron de uno a tres microlitros de agua desionizada sobre la superficie tratada y se midieron los ángulos de contacto utilizando SmartDrop Plus. Este experimento se repitió cinco veces.

Para abordar el papel de la capa de cera cuticular en los efectos de mejora de la penetración, manipulamos intencionalmente la capa de cera. En adultos, el notum torácico se cepilló suavemente varias veces con un hisopo de algodón empapado en n-hexano para eliminar la capa de cera hidrófoba. Las larvas se sumergieron individualmente en una solución saturada de n-eicosano durante 2 s para cubrirlas con una capa de cera artificial. Los adultos desparafinados y las larvas recubiertas de cera artificial se sometieron a la misma aplicación tópica que los individuos intactos. El cambio en la hidrofobicidad resultante de los procesos de manipulación se confirmó dejando caer 5 μL de agua desionizada sobre la superficie tratada usando SmartDrop Plus (Femtofab, Sungnam, Gyeonggi, Corea del Sur; Fig. 1).

Los principales componentes del aceite de tomillo y la penetración cuticular del timol y el p-cimeno se analizaron utilizando un espectrómetro de masas Chromatec-Crystal 9000 (Chromatec, Mari El, Rusia) equipado con una columna Agilent J&W VF-5 ms (60 m, 0,25 mm). ID y 0,25 μm de espesor; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) y un Chromatec-Crystal (Chromatec). El volumen de inyección fue de 1 μL y se utilizó helio (99,999%) con un caudal de 1,5 ml/min como vehículo. La temperatura inicial del horno se fijó en 50 °C durante 5 minutos, luego se aumentó gradualmente a 65, 120, 180, 210 y 305 °C a velocidades crecientes de 10, 5, 5, 5 y 20 °C/min, respectivamente. . Las temperaturas se mantuvieron durante 30, 10, 0, 10 y 5 min. Los datos se analizaron utilizando las bibliotecas NIST MS Search 2.4. Para confirmar el análisis químico del aceite de tomillo, se preparó un aceite artificial mezclando cinco de los componentes principales (> 2 % en composición) en su proporción natural y se volvió a analizar en las mismas condiciones anteriores.

También se examinó la penetración cuticular relativa de timol, p-cimeno y sus mezclas binarias (1:2). Los insectos fueron tratados con los valores LD50 de los compuestos individuales. Los insectos tratados se incubaron durante una hora y se enjuagaron con n-hexano mediante agitación suave. Luego, los insectos se transfirieron a un tubo de microcentrífuga de 2 ml lleno con 1,5 ml de n-hexano y se homogeneizaron utilizando un homogeneizador Bead Beater (Minilys, Bertin Instruments, Montigny-le-bretonneux, Ile-de-France, Francia). Los extractos crudos se filtraron y analizaron inmediatamente mediante GC-MS. Los análisis se repitieron tres veces.

Los valores de LD50 de los compuestos de prueba y del aceite se determinaron mediante análisis Probit. Las diferencias entre grupos en el ensayo de eliminación de compuestos se examinaron mediante ANOVA unidireccional con pruebas post hoc de Tukey. Se utilizaron pruebas t de Student para comparar la penetración cuticular entre los compuestos tratados individualmente y los tratados con mezclas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS versión 25 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.).

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles de ambos autores, JY y J.-HT, previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (NRF-2019R1C1C1004834). Los autores agradecen a Hyo Eun Jeon por el apoyo técnico.

Departamento de Biotecnología Agrícola, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea del Sur

Junho Yoon y Jun Hyung Tak

Instituto de Investigación de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea del Sur

Jun Hyung No

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JY realizó los experimentos. JY y J.-HT concibieron y diseñaron investigaciones, analizaron datos y escribieron manuscritos.

Correspondencia a Jun-Hyung Tak.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Yoon, J., Tak, JH. La propiedad cuticular afecta la sinergia insecticida de los principales componentes del aceite de tomillo contra la mosca doméstica, Musca domestica. Informe científico 13, 12654 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39898-6

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Recibido: 04 de mayo de 2023

Aceptado: 01 de agosto de 2023

Publicado: 04 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39898-6

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